2.5 白菜型油菜srb多室候选基因的白菜转基因功能互补验证

构建Brclv3_Asp12等位基因的超量表达载体并转化拟南芥clv3-2突变体。获得的型油性状析分大部分转基因株系仍都表现为clv3-2的突变表型，包括茎扁平、菜s传分花序茎顶端分生组织显著增大和角果全部为多室等(图4-i～n)。多室的遗本研究也发现，鉴定5个独立的白菜转化家系都能够部分恢复clv3-2突变体的表型，包括部分角果表现为两室(图4-c，型油性状析分d)和较为正常的菜s传分花序顶端分生组织(图4-o，p)；未发现能够完全恢复clv3-2突变表型的多室的遗转基因植株。在这些部分恢复的鉴定转基因家系中BrCLV3基因表达量较clv3-2都显著增加(图4-s)。统计分析表明，白菜它们的型油性状析分心皮数都较clv3-2显著减少，但是菜s传分都未能恢复到野生型的水平(图4-t)。表明Brclv3_Asp12等位基因与已报道的多室的遗BrCLV3功能类似，仍然具有参与茎顶端分生组织大小及多室角果发育调控的鉴定作用，只是功能有所减弱。因此Brclv3_Asp12中的组氨基酸/天冬氨酸突变可以引起BrCLV3等位基因的部分功能丧失，从而导致多室角果的产生。

2.6 白菜型油菜srb中多室候选基因的体外多肽处理验证

为了进一步明确srb中Brclv3_Asp12等位基因变异对其产物的活性影响，本研究针对CLEmotif序列合成了野生型多肽BrCLV3和突变型多肽Brclv3_Asp12，并对拟南芥clv3-2突变体和野生型Ler进行了体外处理。

在液体培养条件下，对拟南芥幼苗的SAM大小进行了测量。经野生型多肽BrCLV3处理后，拟南芥clv3-2突变体的SAM面积显著减小(图5-b，d，e)，与野生型Ler对照在未处理时的SAM面积无显著差异(图5-a，d，e)；表明BrCLV3多肽具有抑制茎顶端分生组织生长的活性，通过添加外源BrCLV3多肽可以将clv3-2突变体中增大的SAM恢复到野生型的状态。在Brclv3_Asp12多肽处理条件下，clv3-2突变体的SAM面积也显著减小，但仍极显著大于BrCLV3多肽处理下的clv3-2突变体以及未处理的野生型Ler(图5-a～e)；表明Brclv3_Asp12中的组氨基酸/天冬氨酸突变可以引起CLV3多肽活性的部分丧失，使其不能正常调控茎顶端分生组织的生长。

前期研究表明，野生型多肽BrCLV3也能显著抑制根系生长。因此，我们在固体培养基上检测了不同多肽处理浓度条件对拟南芥的根长及根顶端分生组织(rootapicalmeristem，RAM)生长的影响。在1nmolL-1BrCLV3多肽或Brclv3Asp12多肽处理条件下，拟南芥的主根长或RAM大小相对于未添加多肽的对照处理无显著差异(图6-a～c，h～j，o，p)。在10nmolL-1多肽处理条件下，Brclv3Asp12多肽处理条件下的拟南芥主根长或RAM大小与未添加多肽的对照处理间无显著差异(图6-a，d，h，k，q，r)；但是BrCLV3多肽处理会显著抑制拟南芥主根或RAM生长(图6-a，e，h，l，q，r)。在100nmolL-1多肽处理条件下，BrCLV3和Brclv3Asp12多肽处理均会极显著抑制拟南芥主根或RAM生长(图6-f，g，m，n，s，t)。该结果进一步证实srb中的Brclv3Asp12具有较低的多肽活性。

3 讨论

很多研究已经证明白菜型油菜的多室性状受1对隐性核基因控制。在前期研究中，我们首次成功图位克隆了白菜型黄籽沙逊ml4中的多室基因；发现Brclv3基因第3个外显子中的1个单核苷酸突变(C/T)导致其CLEmotif中第9位的脯氨酸的突变，从而导致其产生多室表型。在本研究中，遗传分析发现，srb中的多室性状同样受1对隐性核基因控制，这与前人的结果一致；进一步的等位测验发现，srb中的多室基因与ml4中的相同(表2)。比较测序分析发现，srb的CLEmotif中存在一种新的单核苷酸突变(C/G)，可导致该保守结构域的第12位组氨酸突变为天冬氨酸(图2)。进一步通过拟南芥中的遗传转化试验和体外多肽处理试验证实，该单核苷酸突变可以引起BrCLV3基因功能的部分丧失，并引起多室角果的产生(图4～图6)。
 

大量研究表明，拟南芥CLV3基因编码的蛋白经过对CLEmotif的剪切和修饰，最终形成包含12～13个氨基酸的多肽信号来行使其所有功能。已有的研究表明，CLEmotif中每一位氨基酸对CLV3多肽功能的重要性有所不同。为了评估它们的贡献大小，Kondo等通过氨基酸替换和体外多肽处理相结合的方法进行研究发现，R1、P9、H11和H12依次是影响CLV3功能最重要的4个氨基酸，而T2、S5、P7和L10等4个氨基酸的重要性最低。通过体外CLV3多肽信号与其受体进行竞争性结合的试验表明，R1、H12、G6、P4和V3等5个氨基酸是影响CLV3信号与CLV1胞外受体结合最重要的氨基酸。为了在植物体内更为准确地评价每个氨基酸的作用大小，Song等对CLV3多肽进行丙氨酸的替换和拟南芥clv3-2突变体互补转化试验发现，在CLV3调控SAM稳态过程中，D8、H11、G6、P4、R1和P9等6位氨基酸的作用最为重要，其次为H12和L10，而T2、V3、S5和P7等氨基酸的作用并不重要。在这些研究中，P9对CLV3多肽都表现出重要的贡献。因此，当白菜型油菜BrCLV3基因中的第9位脯氨酸发生自然突变时，会导致该基因功能的丧失，并引起多室角果的产生。H12对CLV3多肽的功能也十分重要，但重要性相对P9较弱。因此，不难理解在本研究中新发现的Brclv3Asp12等位突变仅能引起CLV3多肽活性的部分丧失(图4～图6)。由于H12是参与CLV3多肽信号与其受体结合的重要氨基酸，我们推测srb中BrCLV3基因脯氨酸到天冬氨酸的突变可能主要通过减弱CLV3多肽信号与受体结合的能力而降低了其活性。该结论还需要进一步的研究证据去证实。

4 结论

来自我国西藏的白菜型油菜srb具有稳定的多室角果表型，该性状受1对隐性核基因控制，且与黄籽沙逊ml4中的多室基因等位。比较测序分析发现，srb中BrCLV3基因的CLEmotif中存在一种新的单核苷酸突变，可导致该保守结构域的第12位组氨酸突变为天冬氨酸。针对该SNP开发的Brclv3Asp12等位基因特异标记在分离群体中与多室表型共分离表明，该SNP变异可能是引起srb油菜产生多室角果的原因。通过转基因互补测验和体外多肽的处理试验都证明，Brclv3Asp12等位突变可以导致CLV3多肽活性的减弱。因此，本研究推测H12是参与白菜型油菜中CLV3多肽信号与其受体结合的重要氨基酸。

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